OOS(outofspecification,超限度、超規格)結果，是指產品質量指標測試中超出已經建立的可接受標準的單個或一系列結果。無菌產品的陽性結果、微生物限度試驗超出行動值或超過規格、內毒素試驗結果超標準等均為OOS結果《中國藥典》2015年版m和新版《藥品生產質量管理規范》（GMP)增加了OOS調查章節，對微生物實驗室00S結果的調查做出了較為詳細的闡述和實例分析，要求任何OOS結果必須按照書面規程進行完整的調查。因為只有確定了OOS結果產生的原因并判定其是否有效，進而才能制訂完善的預防和整改措施，以保證檢驗結果的準確性。因此，實驗室建立OOS調查處理程序，對OOS結果進行科學、及時、有效的調查分析處理是十分必要的微生物在自然環境中無處不在，并可能會隨檢驗人員、檢驗用器材以及檢品的包裝容器進入檢驗環境。

因此，關于微生物檢驗中藥品的無菌檢査項目，新版藥典對其操作環境提出了更高要求，新版GMP也加強了對無菌操作環境空氣微生物、表面微生物以及人員手套和操作服表面微生物的監測頻率，并做出了明確規定。而對于無菌檢査OOS結果的調査，需核實的相關記錄和影響因素更為繁雜。基于它的復雜性，OOS結果的調查須追溯到實驗過程的每一個環節，而對于它的變異性，調查過程又需針對不同的OOS結果著重分析調查相應的不同環節。

對于微生物實驗室OOS的調查，局限于每個檢驗單位的技術水平和資源，同樣限于人類對微生物掌握的局限，不是每次的OOS調査都可以發現其根本原因，但通過此調査過程仍能夠幫助調查者找出超標結果發生的可能原因并進而采取糾正預防措施，基于風險分析，對相關批次產品做出最后處理決定'從而降低藥品質量風險，既是保證藥品質量的重要工作，又是質量體系持續改進的原動力。本文通過對4批無菌產品的無菌檢査實驗全過程的回顧性分析和調查，探索導致無菌實驗OOS結果的明確原因，以期建立微生物實驗室完善的OOS調査方案。

1、材料、儀器與試劑

全自動智能無菌集菌儀（默克MILLIPORE)；一次性使用全封閉集菌培養器（杭州高得醫療器械有限公司）；

顯微鏡AxioScopeA1(德國ZEISS蔡司公司）；

全自動微生物鑒定儀Vitek2Compact(法國生物梅里埃公司）；

酵母菌鑒定卡（YST,法國生物梅里埃公司)。

無菌檢查樣品為4個批號的注射用頭孢噻膀鈉。

2、方法與結果

2.1實驗方法

2.1.1藥品的無菌檢查

依照《中國藥典》2010年版_檢驗注射用頭孢噻肟鈉的無菌檢查項目。

2.1.2鏡檢及鑒定

取陽性樣本，劃線TSA平板培養24~48h，按照儀器及試劑的使用說明，對經過純化的微生物進行革蘭氏染色，確定微生物形態，然后根據形態選擇鑒定卡，使用全自動微生物鑒定儀Vitek2Compact進行鑒定。

2.2結果

4個批號的注射用頭孢噻肟鈉的無菌檢查檢驗結果如表1所示：2號和4號樣品改良馬丁培養基均在第3天變渾濁。取改良馬丁培養液劃線TSA平板，30~35℃培養48h，平板上呈現白色、光滑、邊緣整齊、形態單一的菌落。

革蘭氏染色鏡檢結果為酵母菌。經全自動微生物鑒定儀Vitek2Compact鑒定，均為季也蒙假絲酵母。

3、OOS結果的調查和分析

依據新版GMP對OOS調查的要求，回顧性分析調查注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查OOS結果產生的原因。

①日常監控和驗收記錄：

培養基的驗收記錄、培養基的制備和滅菌記錄、檢驗器具準備和滅菌記錄、消毒液配置和無菌過濾記錄、潔凈室清潔消毒記錄、檢驗員使用潔凈服的滅菌記錄和使用記錄、無菌檢驗操作記錄以及環境監控記錄等均未發現異常。

②人員：

甲和乙實驗人員均能熟練掌握無菌檢驗的流程、監控要點和無菌操作規范。

③樣品：

確認樣品的編號和批號無誤，無菌檢査取樣前，樣品西林瓶外觀正常，西林瓶蓋并未發現松動的跡象。

④實驗器具：

實驗中使用的KSF330集菌器、一次件使用無菌注射器以及一次性使用無菌手套的無菌驗收均符合規定，且用于當天其他檢品的檢驗，并未發現污染情況。

⑤培養基及沖洗液和稀釋液：

無菌檢查用培養基的陰性對照均符合規定，且同批制備和滅菌的培養基用于同日檢查的其他檢品，并未發現污染情況。

⑥檢驗環境：

現場環境監控的3皿沉降菌監測的TSA平皿均未有菌落生長，并未出現污染情況。定期環境檢測表面菌符合規定，樣品無菌檢查當日潔凈空調系統均運行正常。

⑦不同檢驗體系對結果判定造成的影響：

由于現行《中國藥典》無菌檢查使用的改良馬丁培養基不同于國際標準使用的TSB,將改良馬丁培養物劃線TSA平板上長出的菌落接種至TSB培養液中in),24h后培養液即出現混濁現象。因此可以排除因檢驗體系不同造成的實驗結果偏差。

⑧菌株：

樣品檢出菌經鑒定為季也蒙假絲酵母菌，比對曰常潔凈室監控收集的菌株建立的菌庫，潔凈室中從未監測到此種菌株。

⑨附加實驗的結果與分析：

通過以上分析，初步認定無菌不合格為實驗有效結果。但鑒于此次無菌檢驗過程并未嚴格按照新版GMP和《中國藥典》2015年版規定的對檢驗環境和人員的全面監控，環境和人員帶來的污染仍有造成OOS結果的可能性，附加實驗就是對檢驗環境進行全面監測。

現場環境監控按照新版GMP的要求實施，并增加對潔凈室回風口浮游菌的監測，監測結果均符合規定。微生物監測方面，除實驗人員無菌服胸口處采集到一個菌落，其他均未有菌落生長。實驗人員無菌服采集到的菌落為革蘭氏陽性球菌，經鑒定為Kocuriakristinae(克氏庫克菌），此菌種曾在日常潔凈室監控中不止一次檢出過，并未對樣品產生過污染。

4、結論與討論

OOS結果表明，并未在實驗室發現導致OOS結果的明確原因，檢出菌也并非由于實驗室檢驗過程帶來的污染，懷疑樣品本身被季也蒙假絲酵母菌所污染，從而導致無菌檢查的陽性結果。

通過對上述OOS的調查和分析，初步建立了微生物實驗室OOS結果調查的分析方案，分別從人、機、料、法、環5個方面進行闡述：

人——實驗人員。考察人員是否經過相關檢驗的培訓和考核，是否了解該項檢驗的流程和監控要點。無菌區全體人員每年應進行一次再培訓和資格的再確認，對無菌區人員操作服和手套表面的微生物監測嚴格按新版GMP執行；

機——實驗中使用的儀器設備。檢查儀器近期使用記錄是否發現異常，參數設置是否正確。儀器的計量和校準均需在有效期內，無菌區內使用的儀器需定期消毒并定期進行微生物的表面監測，使用的器具需經滅菌消毒，一次性使用器具需經質量驗收；

料——樣品、培養基、稀釋液和沖洗液。檢查剩余樣品的編號和批號是否準確，樣品的外觀是否異常，瓶蓋是否有松脫現象以及樣品的前期存放條件和取樣方式是否合理。必要時，對樣品的瓶蓋和瓶口等關鍵部位擦抹取樣，培養觀察；

檢查培養基質量驗收記錄和配制記錄，確認配制和滅菌是否合理有效，是否用于其他樣品的檢驗，培養基、稀釋液和沖洗液的陰性對照應符合規定；

法——檢驗方法和依據。實驗所用標準應符合設定實驗和檢驗依據的要求；

環——實驗環境。檢查潔凈空調系統是否運行正常，監測記錄包括定期監控記錄和實驗現場環境監控記錄，是否符合潔凈度要求，清潔記錄顯示是否按時清潔，消毒液是否使用合理。另外，未確定OOS結果產生的明確原因時，不能急于對環境進行消毒處理，以免忽略了可能的環境污染因素。

微生物負荷和實驗檢出菌的比對分析。實驗室的微生物負荷，包括潔凈室的空氣微生物、表面微生物和人員操作服及手套的表面微生物。對日常環境監控收集的菌株進行有效鑒別和分析，建立潔凈室生物負載數據庫，可為微生物OOS調査提供數據基礎。

對檢出菌進行鑒定，分析監控收集的微生物分布和鑒定與陽性結果的相關性，當發現與陽性菌株相近的菌株時，可利用分子生物學方法比對陽性菌株與微生物負荷的同源性，為陽性菌的污染溯源提供依據。

此外，對不同實驗會產生不同的OOS結果，可針對某些相關環節靈活考察。例如，針對不同的微生物，采用不同的監測手段，陽性檢出菌為酵母菌時，增加沙氏葡萄糖瓊脂用于環境監控的附加實驗，則能夠更好地確認環境中的該類微生物。

需要著重強調的是，檢出菌的鑒別對于OOS結果的調查非常關鍵，決定最后是否可以發現根本原因，應該給予足夠重視。

綜上所述，微生物相關檢驗項目OOS結果的調查工作量很大，且專業性強，實驗室不僅需要具備受過良好培訓和具有豐富檢驗經驗的工作人員，還需建立完善的OOS調查方案來規范調查操作。

來源： 制藥在線
編輯整理：德斯特cGMP
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